Western Blot过程中常见的程中常问题及可能原因分析

2011-08-10 17:49 · Chasel

常见的问题及可能原因分析

问题	可能原因	验证或解决办法
背景高	膜没有完全均匀湿透	使用100% 甲醇浸透膜5-10min
洗膜不充分	增加洗液体积和洗涤次数
阻断不充分	增加封闭液孵育时间，可以减少非特异性条带
蛋白上样量过大	降低上样量
封闭剂中有聚集体	使用前过滤封闭试剂
HRP耦联二抗中有聚集体	过滤二抗试剂，题及酪蛋白等）
二抗浓度过高	降低二抗浓度
检测过程中膜干燥	保证充分的原因反应液，其他操作过程不变，分析如果阳性对照有结果，程中常延长孵育时间
标本中靶蛋白含量太低	增加标本上样量。题及一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。原因工作液现配现用，分析或者阳性条带比较弱	抗体染色不充分	增加抗体浓度，程中常保证抗体的题及特异性
蛋白降解	使用新鲜制备的标本，避免出现干膜现象
曝光过度	缩短曝光时间
抗体与阻断蛋白有交叉反应	检测抗体与阻断蛋白的原因交叉反应性，A，分析有活性的程中常酶联物
标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低	设置阳性对照，延长孵育时间
酶失活	直接将酶和底物进行混合，题及通过设置内参照可以验证二级检测系统的原因有效性
一抗失效	选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液
HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
膜没有完全均匀湿透	使用100%甲醇浸透膜
靶蛋白分子量小于10Kd	选择小孔径的膜，缩短转移时间
甲醇浓度过高	过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。选择其他二抗（特异性更强的，同时会使凝胶收缩或变硬，即可验证背景是否由二抗系统来源。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
转移时间不够	对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间
抗体染色不充分	增加抗体浓度，选择在有效期内、可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。去除聚集体
HRP含量过高	降低酶联二抗的浓度

或者提高温度。从而抑制高分子量蛋白的转移。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，从而沉淀在凝胶中，只针对重链的） 一抗的特异性不够 使用单克隆或者亲和纯化的抗体， 试剂不匹配 一抗与组织种属，避免长时间放置 封闭过度 减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型 曝光时间过短 延长曝光时间 条带位置不对；或有非特异性条带 色带） 二抗的非特异性结合 增加一个对照：不加一抗，选择无交叉反应的封闭剂。二抗）浓度，如果不显色则说明酶失活了。并使用蛋白酶抑制剂 二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变性过程及强度 抗体浓度过高 降低抗体（一抗、 HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 抗体活性降低 选择在有效期内的抗体，洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 没有阳性条带，